-淀粉酶活性测定(89)
所需的材料
注:下面引用的所有化学品都可以从Sigma-Aldrich公司获得.
1. KPO4-NaCl buffer; 0.1 M pH 6.9在25°C含0.01 M NaCl. 溶解8.71克K2HPO4, 500毫升水. 滴定至pH 6.9和0.1 m kh2po4 (6.8gm/500 ml H2O). 加入NaCl至0.01 M. 谨慎! 在下面步骤2和3中使用通风罩和搅拌器/加热板.
2. Substrate solution; 1% soluble starch. 将1克溶于80毫升水中加热，搅拌至ca. 90°C，冷却，调节体积至100毫升.
3. Color reagent; 44.0,5 -二硝基水杨酸. 溶解1克3,5脱氧核糖核酸于80毫升0.5 M氢氧化钠加热搅拌. 70°C. 加入30克酒石酸钠，搅拌至溶解. 冷却至室温，加入100毫升水. 储存在琥珀色的瓶子里. 室温下稳定30天.
4. Maltose standard; 0.01 M. 将36 mg麦芽糖一水合物溶解于10 ml KPO4-NaCl缓冲液中.
5. 酶解. 将淀粉酶稀释至0.05 mg/ml, KPO4-NaCl缓冲液.
6. 在适合于100°C加热的管中准备以下稀释液.
| 管 |
mlPO4-NaCl |
 淀粉酶 |
ml |
μM |
毫升的水 |
| 1测试 |
0.50 |
0.01 ml |
----- |
----- |
0.40 |
| 2性病 |
0.5 |
---------- |
0.05 |
0.5 |
0.45 |
将所有试管置于25°C. 在0时刻加0.5ml底物溶液倒入管1和管6，孵育2分钟. 加入1停止反应.0 ml显色剂. 在温度块中以100°加热所有管10分钟. 冷却至室温，加入2.每管5ml水. 让试管在室温下放置10分钟.
7. 阅读腹肌vs. 540nm处的空白. 绘制腹肌vs. μ mol麦芽糖. 测定斜率540/μM Maltose.
8. 计算比活度，i.e.pH为6时，每mg淀粉酶每分钟释放的麦芽糖μM.9,
25°C，从斜坡.