用分光光度法测定弹性分解活性的方法
下面的程序是一个使用Elastin-Rhodamine的例子，200-400目. 其它底物也可同样使用. 每种底物在被弹性蛋白酶溶解后都有不同的吸收性. 染色弹性蛋白可溶性肽的吸光度如下:
Elastin-Rhodamine, 550 nm
弹性荧光素，495nm
Elastin-Orcein, 570 nm
人造刚果红，485 nm
Elastin-Remazol, 595 nm
该过程严格遵循已发表的方法(9、10、11、35、36)。.
步骤1. 已知数量的底物被弹性蛋白酶完全溶解. 测定每毫克底物的光密度.
步骤2. 已知数量的弹性蛋白酶与底物孵育. 每mg弹性蛋白酶溶解底物的量(i).e.(特定活动)是确定的. 一种未知物的弹性分解活性可以通过与弹性酶的活性比较来确定.
所需的材料
1. 底物 Suspension; 20mg/ml in 0.2 M Tris-HCl ph8.8.
2. 缓冲; 0.2 M Tris pH 8.8.
3. 弹性蛋白酶; 2X crystallized or chromatographically purified.
4. 锥形烧瓶，10-25毫升大小或试管.
5. Dubnoff type incubator; equilibrated at 37°C.
6. 电磁搅拌器.
7. 冰浴.
8. 滤纸，Whatman No 41或同等产品.
步骤1. 溶解基底光密度的测定
检查以下方案，移液缓冲液，然后将弹性蛋白酶放入10ml烧瓶中. 通过磁力搅拌使底物保持悬浮状态，使用1向烧瓶中加入等份.0 ml吹出吸管. NOTE> The elastase aliquot should contain 20-30 units activity. 这是一个多余的量，必须在30-60分钟内完全溶解基材.
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观察到的 |
O.D. 每毫克 |
| 瓶 |
缓冲 |
弹性蛋白酶 |
底物 |
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O.D. |
衬底(计算) |
| (No.) |
(ml) |
(ml) |
(ml) |
(mg) |
-------- |
-------- |
| 1(空白) |
2.90 |
0.10 |
0 |
0 |
-------- |
-------- |
| 2 |
2.65 |
0.10 |
0.25 |
5.0 |
-------- |
-------- |
| 3 |
2.40 |
0.10 |
0.50 |
10.0 |
-------- |
-------- |
| 4 |
2.15 |
0.10 |
0.75 |
15.0 |
-------- |
-------- |
| 5 |
1.90 |
0.10 |
1.00 |
20.0 |
-------- |
-------- |
关闭烧瓶，在37°下孵育，每分钟40-60次，直到所有底物都被溶解(30 -60分钟)。. 用缓冲液将体积调到10ml，读出O值.D. 在10毫米的比色皿中对照空白. 必须配制二次稀释剂，使所有读数落在分光光度计的范围内. 记录每个0.D. 每毫克(乘以稀释系数)，并计算O.D. 每毫克底物. O.D. 每毫克应几乎恒定(±5%). 一个O的图.D. 相对于底物的浓度应该是一条直线.
步骤2. 单位弹性分解活性的测定
检查以下方案，将缓冲液、弹性蛋白酶和底物移液管放入10ml烧瓶中. 在输送等分液时，保持基质悬浮状态. 弹性蛋白酶的浓度应为0.缓冲液中2mg / ml.
消光系数:Î， 1%， 280 nm = 19.5 A280x 0.51 = mg/ml
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观察到的 |
O.D. 每毫克 |
| 瓶 |
缓冲 |
弹性蛋白酶 |
底物 |
|
O.D. |
衬底(计算) |
| (No.) |
(ml) |
(ml) |
(ml) |
(mg) |
0 |
0 |
| 1(空白) |
2.0 |
0 |
0 |
1.0 |
-------- |
-------- |
| 2 |
1.9 |
0.1 |
0.02 |
1.0 |
-------- |
-------- |
| 3 |
1.8 |
0.2 |
0.04 |
1.0 |
-------- |
-------- |
| 4 |
1.7 |
0.3 |
0.06 |
1.0 |
-------- |
-------- |
| 5 |
1.6 |
0.4 |
0.08 |
1.0 |
-------- |
-------- |
| 6 |
1.5 |
0.5 |
0.10 |
1.0 |
-------- |
-------- |
盖上瓶盖，在37°C下摇温20分钟. 将烧瓶浸入冰中，用冷缓冲液将体积增加到10毫升. 快速过滤No. 41张纸放入比色皿中，读出O.D. 滤液对空白的影响. 观察到的记录.D. 通过除以观察到的O来计算溶解底物的mg.D. 除以常数0.D. 每毫克先前在步骤1中测定.
观察到的啊.D.
单位 = 溶解底物 = O.D./ mg底物
毫克 mg弹性蛋白酶 mg弹性蛋白酶
计算每毫克弹性蛋白酶溶解的底物. 最后的计算给出了具体的活动. 最广泛使用的单位定义的特定弹性分解活性是:一个单位将溶解1mg弹性蛋白在20分钟pH值8.8和37°C.
未知物的弹性分解活性可以通过在上述过程中将未知物的等量替换为弹性酶来确定. The relative amounts of buffer and unknown can be varied; however, 孵育的最终体积(3ml), pH值(8).8)和摩尔浓度(0.2 M Tris)必须是常数.
用荧光法测定弹性分解活性
相同的程序(上述)用于测定溶解底物的荧光强度和测定单位弹性分解活性. 弹性蛋白荧光素和弹性蛋白罗丹明都是合适的底物. 通常滤液必须用缓冲液稀释，使荧光强度读数落在荧光计的读出能力之内.
当使用Elastin Fluorescein作为底物时，读取荧光强度，激发和发射波长分别设置为490nm和520nm, 分别. 当使用弹性蛋白罗丹明时，激发和发射设置分别为550nm和570 nm.